摘要: 目的　提高马尔尼菲青霉菌( PMA) 培养鉴定在基层实验室的诊断水平。方法　取患者血液或骨髓液置于BacT/ Alert 3D 血培养仪系统配套的成人中和抗生素培养瓶,经培养提示阳性,取阳性培养物和淋巴结组织涂片、革兰染色镜检见病原体有细长分枝、分隔菌丝、腊肠形菌体, 转种到哥伦比亚血平板、萨布罗琼脂及CHROMagar 假丝酵母菌显色培养基,观察25 ℃和35 ℃孵育时的菌落形态及镜下菌体特征;测试相关生化反应,观察其结果。结果　PMA 培养鉴别依据:是双相型真菌,25 ℃培养为真菌相,35 ℃培养为酵母相,均能产生葡萄酒红色色素;显微镜下菌体形态:25 ℃培养有典型的帚状枝,35 ℃培养可见圆形、卵圆形、两端钝圆略弯曲呈腊肠形有横隔菌体;生化结果:都能同化和发酵葡萄糖产酸,脲素酶阳性, 都能被放线菌酮环己酰亚胺抑制,不能同化发酵乳糖。结论　PMA 适宜的培养基是萨布罗培养基,菌体形态结构适宜的染色是乳酸棉兰染色、革兰染色,适宜基层实验室开展。

关键词: 马尔尼菲青霉菌; 分离; 鉴定; 双相培养特征

马尔尼菲青霉菌( Penici l l i um marnef f ei ,PMA) 是马尔尼菲青霉菌病(penicilliosesis marnef2fei ,PSM) 的病原体,主要侵犯单核2巨噬细胞系统引

起全身广泛播散性重度深部真菌病,不及时治疗死亡率极高。3 年来,我们通过对120 株PMA 在镜检观察、生化反应、接种在不同培养基及不同孵育温度生长特点等方面进行了系统研究,总结出些特点,提高了PMA 的分离率和鉴定率。

1 　材料与方法

1. 1 　材料

1. 1. 1 　菌株来源　收集2005 年12 月- 2008 年11月我院经双相培养证实的PMA 菌株120 株,标本种类:血液114 例,淋巴结组织3 例,骨髓3 例。剔除同患者相同标本分离到的重复菌株。120 例全是住院AIDS 患者,其中男性96 例,女性24 例,年龄在18 月龄～80 岁,平均38. 5 岁。

1. 1. 2 　仪器设备　Bac T/ Alert3D 血培养仪、GZX2DH 电热孵育箱、二生物安全柜(上海博迅实业有限公司)、OL YMPUSI2BX51系统显微镜。

1. 1. 3 　主要培养基和试剂　Bac T/ Alert 3D 全自动血培养系统配套的培养瓶,哥伦比亚琼脂干粉,萨布罗培养基(SDA) 干粉等。

1. 2 　方法　

(1) 标本前处理:血液标本由病房护士采集血液8～10 ml 接种成人中和抗生素培养瓶、骨髓由病房医师采集0. 2～1 ml 注入如上培养瓶中、淋巴结组织由病房采集装入无菌管中,以上标本要求在30 min 内送至微生物室。

(2) 标本培养:血培养瓶直接放入Bac T/ Alert 3D 血培养仪进行培养。真菌培养基和生化管用标准菌株A TCC 10231 白色假丝酵母菌做质控合格后使用。

(3) 菌株同化试验:用API 20C AUX 鉴定条按说明书提示操作步骤操作。

(4) 各种染色与试验: 革兰染色、PAS 染色、乳酸棉兰染色、HE 染色按《全临床检验操作规程》(3 版) 操作。

(5) 试验方法:尿素水解试验、放线菌酮环己酰亚胺耐受试验和硝酸盐同化试验参照文献[ 1 ]操作。凡是接种、涂片及观察结果均在生物安全柜中操作。

2 　结　果

2. 1 　阳性时间观察结果　血培养瓶直接放入Bac T/ Alert3D 血培养仪进行培养,检出阳性时间观察:24 h 内为8 例,24～48 h 为46 例,48～72 h 为53 例。72 h 后为10 例,平均53 h ,阳性检出曲线呈缓慢抬高趋势。

2. 2 　两种温度孵育下不同培养基上菌落形态

2. 2. 1 　25 ℃培养特征　菌落呈真菌相。

2. 2. 1. 1 　萨布罗琼脂斜面培养基　2 d 可见生长,菌落初期呈白色、灰白色或褐色菌落,中间有少许绒毛出现,菌落直径约有2～5 mm ;3～5 d ,菌落呈绒毛状,颜色可有白色、灰色、黄色、红色,常见中间为黄色或粉红色周围为灰白色, 菌落直径约有5 ～12 mm ,菌落下面及周围出现酒红色;10～15 d ,菌落的绒毛逐渐出现融并慢慢趋向红色;30 d 后,绒毛融成片呈红色,整个培养基变成葡萄酒红色。

3 　讨　论

　　马尔尼菲青霉菌属于青霉菌属,是该菌属中惟的双相型真菌 ,全球约十多个家和地区发现PMA 感染者,尤其以中南部和东南亚居多,而在泰北部已成为艾滋病患者的3 位常见机会菌感染。近10 年来,在我的南方随着HIV 患者增加,AIDS 合并PSM 越来越常见,临床表现与HIV

患者感染肺结核、组织胞浆菌或隐球酵母菌相似,呈隐匿或急性,潜伏期尚未完全确定。PMA 菌适宜的培养基是萨布罗培养基,也是真菌培养常用的培养基。针对PMA 的染色大多推荐PAS 染色而PAS 染色操作复杂,技术要求较高。通过观察比较,认为菌体形态结构适宜的染色是乳酸棉兰染色、革兰染色。